Załoga twierdzy przystąpiła do powstania 5 XII, po misji emisariusza Andrzeja Koźmiana. Przebywali tu wówczas dwaj generałowie E. Żółtowski d-ca 2 DP i J. Czyżewski, jego zastępca. Znajdujący się w mieście Rossyanie poddali się (150 oficerów, podoficerów, szeregowych), a cały garnizon przypiął białe kokardy. Naprawiono i umocniono fortyfikacje (do 17 I). Przy aprowizacji i organizacji służb magazynowych (do 24 I), chwalebnie zapisał się Aleksander Wereszczyński. Zamość do lipca pełnił rolę punktu wypadowego, schronienia dla powstańczych korpusów.
Pod dowództwem płk. Jana Krysińskiego, który 6 II objął twierdzę znajdowało się ok. 4 tys. żołnierzy (4 bataliony piechoty, szwadron jazdy, bateria artylerii, kompania saperów). Z walecznym mjr. D. Bulewskim na czele organizowano liczne zwycięskie wypady, aż po Hrubieszów, Uściług i Janów, dezorganizując siły rosyjskie, dokonywano rekonesansów na szlakach komunikacyjnych. W twierdzy przebywały pewien czas korpusy, najpierw gen. J. Dwernickiego (od 15 III na przeszło dwa tygodnie), potem gen. W. Chrzanowskiego.
Przez Zamość szły znaczne transporty broni dla powstania (organizator Izydor Pietruski), uformowany został też oddział K. Różyckiego. Ważną rolę odegrał też dwumiesięczna obecność płk Ignacego Prądzyńskiego (Rozwinąłem swoją czynność w Zamościu, ażeby fortecę pozostawić w należytym stanie obrony. Zajmowałem się artylerią, zaopatrzeniem, lazaretami i umocnieniami, ponadto zorganizował oddziały wypadowe, m.in. szwadron "Krakusów". W tym czasie kilkakrotnie zbliżyły się do Zamościa większe jednostki rosyjskie, lecz stopniowo ich pierścień wokół twierdzy zaczął się zacieśniać. 16 III 1831 płomienne kazanie wygłosił w Zamościu o. Józef Gacki, pijar, wiceprzewodniczący Towarzystwa Patriotycznego. Pierwszoplanowe role odgrywał też ks. Pułaski z patriotycznymi kazaniami w Kolegiacie oraz kapelan ks. Szynglarski, który święcił złożoną przed ołtarzem broń korpusu Dwernickiego. W V 1831 utrzymywanych dotąd w Zamościu rosyjskich niewolników odesłali powstańcy do m. Pilicy. Odparto ataki Rosjan na Bramę Szczebrzeską 9 VII (od Nowej Osady) i 14 VIII.
Nastąpiła blokada, a od 18 VII oblężenie Zamościa, gdy stanęły w promieniu mili dwa duże korpusy (24 tys. żołnierzy) gen. Rotha, który jesienią opuścił przedpole twierdzy (namawiał wielokrotnie do poddania) i gen. Paisija Kajzarowa, który z ok. 10 tys. wojska dowodził oblężeniem aż do końca.
Jak wspominali oblężeni wesoło i gwarnie płynęło życie w Zamościu. Ton nadawali ochotnicy z Podola, wśród nich dwaj poeci: Maurycy Gosławski, w kolejnych wierszach oddając panujące w twierdzy nastroje  i Franciszek Kowalski, który napisał w twierdzy słynną pieśń Tam na błoniu błyszczy kwiecie. Udanymi wycieczkami również popisywał się inny Podolak mjr Adam Wereszczyński na czele dwóch szwadronów. Warto zwrócić na jeszcze jeden aspekt oblężenia - wynalazki, które w tym czasie tu powstały.
Jeszcze we wrześniu jednomyślnie nie dopuszczano myśli o kapitulacji, nie dowierzano Rosjanom o zajęciu Warszawy, a ci 22 IX, po 8 dniach zerwali zawieszenie broni i przystąpili do ostrzału. Twierdza mogła się jeszcze bronić, posiadała zapasy amunicji i żywności, jednak powstanie upadło i dalszy opór ostatniej w kraju twierdzy stał się bezcelowy. Kajzarow zgodził się na wysłanie oficerów do Warszawy by przekonali się o sytuacji w kraju (majorowie Burakowski i Wereszczyński oraz porucznik). Mimo to 7 z pośród 115 oficerów - pełnych straceńczego romantyzmu - głosowało za walką do końca (zginiemy z orężem w ręku, tej niestety tak już małej ojczyzny, Zamościa), wysadzeniem twierdzy. Podolacy proponowali też przebicie się z bronią do Galicji.
22 X Bramą Lwowską (nową) z twierdzy wyszedł ostatni żołnierz powstania listopadowego, a Rosjanie na znak triumfu oddali 101 salw armatnich. Szlachetny gen. Kajzarow gwarantował wojsku wolność, broń złożyć mieli szeregowi, oficerowie z bronią i końmi, lecz mściwy Paskiewicz złamał przyrzeczenie. Tak zakończyła się obrona twierdzy, która wskutek błędnych decyzji przywódców powstania, nie odegrała roli do jakiej była przygotowana.
W stulecie Rada Miejska zarządziła wmurowanie tablicy (nie doszło jednak do tego).

 * Obsada twierdzy: bataliony 2 p.p. (528 żołnierzy), 3 p.p. (822), 4 p.p. (848) i 7 p.p. (961), oddział saperów (218), 2 kompanie artylerii garnizonowej (224), 3 batalion weteranów czynnych (224), oddział kompanii rzemieślniczej (17), kompania hakowników (95), oddział krakusów (56).
 * Podstawowym zadaniem Andrzeja Koźmiana było przekazanie rozkazów z Warszawy wydanych przez gen. Chłopickiego, jak również przekazanie poleceń Rady Administracyjnej. Dysponował też informacjami o zgodzie Ks. Konstantego, aby wojska polskie powróciły do Warszawy. W Zamościu 4 grudnia rano przebudzony dowódca po wręczeniu mu pisma wodza naczelnego przyjął mnie ozięble, z widoczną niechęcią i rozkazał czekać, a sam wrócił do swojego w pokoju, by przybrać się w mundur. Podglądając opór ze strony gen. Hurtiga, nie czekając na jego powrót – zażądałem aby żołnierz na straży wypuścił mnie pod pozorem potrzeby wyjścia i oddaliłem się do gen. Żółtowskiego, dowódcy dywizji piechoty, w nadziei, że w nim znajdę większą gotowość do usłuchania rozkazów Chłopickiego. Przebudzony generał wyszedł do mnie, a gdy mu i pismo do niego przeznaczone i bieg wypadków opowiedziałem i kopię listu Konstantego okazałem, nie wahając się na chwilę posłał po dowódców pułków Zawadzkiego j Wolskiego i gotowość do połączenia ze sprawą narodową oświadczył. Wkrótce nadszedł gen. Hurtig i spytał groźno co tam robię i czemu w jego mieszkaniu nie czekam. Lecz gdy Żółtowski oświadczył mu, że żadne wahanie miejsca mieć nie może, że on posłuszny odebranym rozkazom natychmiast z brygadą w Zamościu i koło Zamościa rozłożoną ruszy pod Warszawę, że każdy objawiający wątpliwość, jako zdrajca sprawy narodowej powinien być uważany. Hurtig widząc się w swych zamiarach nie poparty, objawił poddanie się woli gen. Chłopickiego, oddział Rosjan rozbroić i przytrzymać przyrzekł. Gdy nadeszli dowódcy pułków, Żółtowski nakazał im, aby bez żadnej zwłoki gotowali się z pułkami do pochodu. Dopełniwszy pomyślnie danego mi polecenia pożegnałem generała.
5 XII rano opuścił twierdzę – Już słońce wznosiło się do góry, gdym wyjeżdżał z Zamościa. Była to niedziela. Na widok moich białych kokard i śpiesznej jazdy, włościanie idący na nabożeństwo, domyśliwszy się jakim byłem posłańcem, uchylali czapki, wołając z uniesieniem, „Niech żyje Polska”. Odpowiadając podobnym okrzykiem, łzy rozrzewnienia roniąc.
 * Do Zamościa przybyło nam wielu ochotników: zacni Galicjanie coraz liczniej się zgłaszali w uzbrojeniu z końmi i całym rynsztunkiem, po 20 do 40 koni przyprowadzali nam prawie codziennie. Gdyby nie te zasiłki w koniach, nie było nam podobna zorganizować się na konną baterię. Przed opuszczeniem twierdzy mieliśmy nabożeństwo w kościele św. Michała [ ]. Patriotyczne kazanie mieli tu ks. Szyndlarski ozdobiony krzyżem złotym wojskowym za waleczność i pijar ks. Gacki, kapelani korpusowi. Błagano Wszechmocnego o dalsza szczęśliwą pomyślność dla polskiego oręża, a to łącznie z braćmi swymi, garnizon Zamościa składający. Obrzęd ten uświetnił Waleczny Jenerał Dwernicki z oficerami korpusu swego, jako też pułkownik Krysiński z Officerami garnizonu i wojskiem, Po odśpiewaniu suplikacji i daniem błogosławieństwa wojsku, ks. Szynglarski poświęcił pałasze dowódców. (ze wspomnień Ignacego Maciejowskiego żołnierza gen. Dwernickiego, 1831)
 * 26 VIII zaszła pod Zamościem bitwa. Moskale utracili 1000 ludzi w zabitych i pułkownika. jenerał moskiewski ciężko raniony pomimo udzielonego mu ratunku przez naszego chirurga Richtera z ran umarł. ("Gazeta Krakowska" z 7 IX 1831)
 * Zgodnie z postanowieniem Rządu Tymczasowego z 4 XII 1830 do twierdzy planowano dostarczyć 5 tys. korców (640 tys. litrów) żyta, 3 tys. jęczmienia, 4,6 tys. owsa, 8 tys. cetnarów (518 t.) słomy i 7 tys. siana, 1400 szt. bydła. Komisja Rządowa wyasygnowała komendantowi twierdzy 165 tys. zł na zakup słoniny, wódki, drewna opałowego i świec. Gminy otrzymały polecenie skupowania dla twierdzy m.in. sera, masła, cebuli, czosnku, chrzanu i drobiu. Komendant prosił aby dostarczać ziarno już przerobione na mąkę (w beczkach) i kaszę  (w workach) by mniej ryzykować zepsuciem. (za J. Feduszką)
 * List z Zamościa 22 VII pisany przez oficera artylerii do Olkusza -  Donoszę iż Kajzarow podstąpił pod twierdzę i od kilku dni ciągle (o on nas, to na wzajem my jego korpus alarmujemy. - Onegdajszej nocy pod Jarosławcem pluton naszych krakusów uderzył na kolumnę złożoną z jednego pułku huzarów i 150 kozaków, porąbawszy kilkunastu huzarów zaczął rejterować ku zasadzce zrobionej z naszej piechoty; nieprzyjaciel natarczywie postępując całą kolumną za naszym plutonikiem, niespostrzegł ukrytej piechoty; która go rzęsistym karabinowym ogniem przywitała. Cofnął się natychmiast w największym nieładzie zostawiwszy na placu 74 zabitych; z naszej strony żaden człowiek nie zginął. Wczoraj nieprzyjaciel spalił przedmieście Nowego Miasta. Ażeby uchronić miasto przed pożarem, wyszliśmy z twierdzy dla odpędzenia podpalaczy, którzy za okazaniem się naszych, natychmiast cofnęli się do swoich kolumn; odebraliśmy rozkaz od gubernatora, ażeby trzy razy mocniejszego nieprzyjaciela wyprzeć z jego pozycji. Ruszyliśmy więc naprzód i wkrótce nieprzyjaciel rozpoczął mocną kanonadę z dział pozycyjnych, my odpowiadaliśmy z dział sześciofuntowych i trzyfuntowych. Po kilkugodzinnej kanonadzie, zaczął nieprzyjaciel ustępować, my poszliśmy za nim i do godziny 7 wieczór odparliśmy go o mile drogi od twierdzy (rozpoczęła się kanonada o godzinie 11 z rana i po kilkugodzinnym ogniu wróciliśmy szczęśliwie do twierdzy; ja jestem tak zdrów jakem z niej wyszedł. Strata nasza jest prawie żadna, albowiem mamy tylko 2 konie zabite i jednego krakusa rannego. Winniśmy za to wdzięczność artylerzystom rosyjskim, których nieład do tego stopnia był posunięty, iż zaczęli do nas brandkulami strzelać; z tych jedna tak blisko mnie przeleciała, iż ogień z niej dobywający się szlifę mi opalił. Ja jednym trzyfuntowym działem odpowiadałem na 4 pozycyjne nieprzyjacielskie tak szczęśliwie, iż zdemontowałem im dwa działa nim mi nadeszły w pomoc 2 sześciofuntowe i 1 trzyfuntowe, a drugie dwa wkrótce musiały ustąpić; gdyż kolumny stojące w tyle dział, niemogły wytrzymać mego ognia. Strata nieprzyjaciela musi być znaczną albowiem kilkanaście domów zawalonych jest rannymi. Wzięliśmy do niewoli kapitana, który własną ręką zapalał domy na przedmieściu; i z najzimniejszą krwią przysłuchiwał się jękom konających dzieci w płomieniach. - Bądź zdrów kochany Ferdynandzie! spieszę na wały, gdyż w ten moment słychać strzelanie z dział. ("Goniec Krakowski" z 1 VIII 1831)
 * W wyniku represji popowstaniowych wśród skazanych na karę śmierci powstańców byli Zamościanie - Antoni Bojarski (podoficer pułku grenadierów gwardii, szkoła podchorążych piechoty) i Wincenty Hirszpel (podchorąży batalionu saperów, szkoła zimowa artylerii).
 * W 1930, w stulecie wybuchu Powstania Listopadowego umieszczono w Celi Łukasińskiego pamiątkową tablicę, odprawiono nabożeństwa w kolegiacie i synagodze, podczas akademii przemawiał Z. Krauze.