Kapituła jest zespołem duchownych zorganizowanym przy kościele dla podniesienia kultu Bożego. Powstała na prośbę Jana Zamoyskiego przy Kolegiacie bullą erekcyjną papieża Klemensa VIII z 5 X 1594, (23 XII t. r. nadał także przywilej pontyfikaliów). Zachodziła między nią i Akademią ścisła łączność organizacyjna. Prawo do kanonii kapitulnych mieli zasłużeni profesorowie Akademii. Godność ta miała być nagrodą i uzupełnieniem uposażenia profesorskiego. Po raz pierwszy Kapituła Kolegiacka zebrała się 17 VIII 1609, ustanawiając statut, w którym określono szczegółowo jej organizację i stosunek do Akademii. Składała się z 3 prałatów i 4 kanonii. Na jej czele stał infułat (osobne hasło). Oprócz infułata - dziekana Kapituły, dwoma pozostałymi prałatami byli: scholastyk (osobne hasło) i kustosz. Pierwszy nadzorował Akademię, drugi miał w swej pieczy skarbiec i sprawy gospodarcze Kapituły. Posługiwano się pieczęcią przedstawiającą św. Tomasza w całej postaci, z głową w promieniach, w rękach z włócznią i sercem gorejącym, z herbem Jelita obok.
Kanonicy
w swojej pierwotnej liczbie nie mogli zaspokoić potrzeb uczelni i około poł. XVII w. zaczęło dochodzić do następnych fundacji. Fundatorami byli przeważnie duchowni, którzy jednak wyraźnie podkreślali akademickie przeznaczenie zapisów. Powstawały w 1648, 1660, 1664, 1694 i następne w XVIII w. (do 1748). Z 17 członków Kapituły, poza pierwotnymi, na których prezentowanie należało do ordynata, na pozostałe proponowała przeważnie sama Kapituła. Do objęcia kanonii wystarczały niższe święcenia. Kanonicy zwolnieni byli z rezydowania przy Kolegiacie. Zbierano się zwykle 2 razy w ciągu roku. Początkowo Kanonicy mieli prawo do noszenia fioletowego mantoletu (pelerynki) i czarnego mucetu (czapeczki).
Na uposażenie Kapituły (łącznie z infułatem) składały się dochody z nadanych jej 6 wsi. Te z czasem nie wystarczające fundusze wzbogaciły w następnych latach różnego rodzaju darowizny, których łączna suma do 1784 wynosiła 225 tys. zł (największą - 100 tys. zł - zapisała w 1672 Gryzelda Wiśniowiecka). Jednak trudności z egzekwowaniem niektórych zapisów i coraz mniejsze dochody z wsi zubożały majątek kapitulny. Największy rozkwit Kapituły przypadł na wiek XVII i XVIII, a związany był ściśle z Akademią i ordynacją. Obok urzędowego wpływu na Akademię, Kapituła poprzez infułata odgrywała znaczną rolę w dziejach ordynacji (okresy niepełnoletności ordynatów, arbitraż w sprawach rodzinnych). Autorytet duchowy i pozycja materialna członków Kapituły nie pozostawała również bez wpływu na życie miasta.
Zmierzch Kapituły nastąpił z zaborem miasta przez Austrię, a w konsekwencji kasata Akademii i samej Kapituły, zamkniętej przez cesarza Józefa II z dniem 21 VI 1784. Członkowie Kapituły nie uznali aktu kasacyjnego. Wskutek próśb i starań ordynata oraz infułata 10 II 1792 cesarz Leopold II przywrócił ją do życia, pod warunkiem, iż jej członkowie zajmą się pracą duszpasterską (Akademia już nie istniała). Bezpowrotnie pozbawiono Kapitułę uposażeń (do 1866 infułat zachowywał jeszcze swoje prawa i przywileje).
Z zamianą miasta w twierdzę nastąpił nowy kryzys. W 1820 ordynat wystąpił nawet z pomysłem przeniesienia kapituły do Szczebrzeszyna. W 1829 aż 9 miejsc wakowało, a 8 członków Kapituły mieszkało poza Zamościem. Była wówczas jedną z 8 istniejących kapituł kolegiackich (przed rozbiorami 53). W jej obronie stanął znienawidzony książe Konstanty, który wystarał się o połączenie godności infułata i naczelnego kapelana Wojsk Polskich. Nowi infułaci nie interesowali się Kapitułą, nie znali jej przepisów, ale takie połączenie pozwoliło przetrwać Kapitule najgorszy okres, gdy obsadzone były często tylko 3 miejsca (w 1870-71 tylko 1). Po reorganizacji w 1838 Kapituła składać się miała tylko z 3 prałatur i 5 kanonii. Do rezydowania przy Kolegiacie zobowiązano tylko infułata, reszta członków miała stawać w Zamościu tylko w niektóre święta. Z końcem wieku, gdy gen. Hurko zabronił mianowań kanoniczych, były ich  już tylko resztki. W 1912 była jedną z 5 w Królestwie obok Łowicza, Kalisza. Łowicza, Opatowa i Pułtuska oraz w Ołyce, Gnieźnie, Kruszwicy i Poznaniu (1772 - 56), a liczyła 2 prałatów i 4 kanoników.
W 1921 papież Benedykt XV ustalił ostateczną liczbę członków gremium kapitulnego, do którego wchodzić miało odtąd poza 3 prałatami - 12 kanoników. Od 1924 nadawano również tytuły kanoników honorowych (przed wojną najwięcej w 1939 - 27, 1985 - 73). Ustalone zostały też nowe stroje kanonickie: czerwona rokieta (komża), czarny mucet z czerwona podszewką (również guziki tegoż koloru), a także ośmiokątny pektorał (krzyż noszony na piersi). W 1958 na prośbę infułata papież Pius XII na pamiątkę męczeństwa ziemi zamojskiej w czasie okupacji udzielił członkom Kapituły przywileju noszenia rubinowego pasa. Kolor ten ma też od tej pory podbitka rokietu oraz obszywki sutanny i biretu.
Odtąd członkami Kapituły zostają zasłużeni duszpasterze z terenu całej diecezji. Spotykają się podczas dorocznego odpustu kapitulnego (pierwsza niedziela po Wielkanocy), uczestnicząc m.in. w uroczystej procesji. Kapituła stawiła się w Zamościu równie licznie z okazji odsłonięcia pomnika Jana Pawła II (1988). 
Dekretem papieskim wraz z powstaniem diecezji zamojsko-lubaczowskiej (25 III 1992) kapituła kolegiacka została podniesiona do rangi kapituły katedralnej i odtąd składała się z dziekana (ks. Jacek Żórawski) i 14 kanoników gremialnych (1998), wśród nich wyżsi rangą - penitencjarz (od 1996), sekretarz i skarbnik (od 1997).


 * W 1925 scholastykiem był Bolesław Malinowski, a kustoszem Leon Wydżga. W 1966 infułatem Józef Dąbrowski, kustoszem Józef Cieślicki (od 1959, w 1958 zm. Wacław Krasucki), scholastykiem Wacław Kowalski  (od 1959).
 * Kapitule poświęcony został nr 4 z 1994 "Zamojskiego Informatora Diecezjalnego".