Nazywane także szarytkami (charite - miłosierdzie). Sprowadzone ze Lwowa w 1784, zajęły na szpital klasztor franciszkański, przejmując chorych i inwentarz szpitalny po skasowanym zakonie bonifratrów. W 1791 przeniesione do zabudowań po klaryskach. Trzy z ośmiu zakonnic prowadziły duży, mający dobrą opinię szpital (rocznie do 500 chorych), często przepełniony (jednorazowo wg zachowanego spisu z III 1810 - 31 kobiet i 27 mężczyzn) i aptekę.  Mimo wsparcia ordynata (8 tys. zł) i mieszczan (zapisy Wolfa Szyfa 6 tys., Franciszka Geislera 4 tys.) zakonnice, kapelan, służba szpitalna i folwarczna (wieś Jatutów i folwarczek na Podstawiu) i  cierpiało niedostatek.
Jedna z sióstr jako nauczycielka prowadziła szkołę dla edukujących się panienek (czytanie, pisanie, religia, roboty na drutach), od 1787 dofinansowywaną przez rząd. W 1783 przełożonej Ludwice Zawadzkiej, ktoś z mieszczan ofiarował 5 obrazów olejnych. W 1804 przewodziła 8 miejscowym siostrom. W obawie przed oblężeniem wyjednały sobie zgodę na przeniesienie latem 1812 do Szczebrzeszyna. Zabrały również przejęty po bonifratrach cudowny obraz MB Łaskawej. Na przełomie XIX/XX w. w zamojskim szpitalu pracowało kilka prawosławnych sióstr miłosierdzia.