Po powstaniu styczniowym agresywna propaganda rosyjska, pomijała fakt istnienia kościoła i Kolegiaty pisząc, że w XVI w. ludność Zamościa prawie wyłącznie składała się z prawosławnych Rosjan („Dziennik Warszawski” 1870 nr 100)!  I dopiero w 1589 Zamoyski powołał inne narodowości do osiedlenia się pomiędzy Rosjanami.
Obok cerkiewki unickiej na przedmieściu powstała z ofiar tych prawosławnych Rosjan skromna cerkiewka św. Mikołaja w murach miasta. Wiązała się z przywilejem wydanym przez Jana Zamoyskiego w 1589 (cerkiew, szkoła, później bractwo) dla Greków. Do cerkwi należało też kilka domów, przytułek, szpital. W 1606 powstało ruskie bractwo prawosławne św. Mikołaja (Bractwa cerkiewne), podległe patriarsze konstantynopolitańskiemu, zatwierdzone 30 III 1606. Bractwo przejęło cerkiew grecką, zob. Cerkiew p.w. św. Mikołaja i wraz z nią otrzymało prawa stauropigii, a ponadto utworzyło szkołę bracką. Z czasem stopniowo opuszczano prawosławie.
Wobec ciągłych sporów z cerkiewką na przedmieściu zajmowaną przez unitów, na prośbę Anny Zamoyskiej bp chełmski w 1690 usunął z cerkwi schizmatyków, jednak jeszcze w 1697 przy prawowiernej cerkwi Mikołaja Cudotwórcy, posługę sprawowali dwaj duchowni, czerńcy. Mimo oporu przeciw unii bractwo zmuszono 10 IV 1690 do jej przyjęcia. W 1753 na mocy papieskiego dokumentu, w miejsce bractwa św. Mikołaja, powstało bractwo unickie św. Onufrego.
Prawosławni wrócili z zaborem rosyjskim. W VII 1871 przejęli cerkiew, tworząc przy niej parafię, 28 V 1875 w Zamościu prawosławie  przejęło 44 duchownych i 51 parafii  z 3 powiatów. W 1876 reaktywowane zostało bractwo św. Mikołaja, aby wspierać materialnie cerkiew, szkoły (na Podtopolu ok. 30 uczniów) i organizacje prawosławne. Po kasacie twierdzy na rzecz cerkwi przeszły liczne grunty miejskie (m.in. Pl. Wolności, tereny ZOO, część parkingu przy PZU).
Od 1867 działał tu ks. Antoni Reszetyłowicz, który rozległą aktywnością działał na rzecz przechodzenia na prawosławie. Na pocz. wieku w Królestwie Pol. z 600 księży, aż 30 wywodziło się z zamojskich szkół. Wg kalendarza na rok 1911 była cerkiew Mikołaja Cudotwórcy (proboszcz Piotr Gapanowicz, Hapanowicz) i cerkiew Nierukotworiennogo Obrazu Spasitiela (Emilian Biekarewicz). W 1913 Gapanowicz, wobec ciasnej "starożytnej" cerkwi mogącej pomieścić 200 osób i podobnej wielkością cerkwi w pałacu, przy 900 wyznawcach, zwrócił się o przekazanie im kościoła franciszkanów.  W 1913 odbył się tu II gubernialny zjazd chórów cerkiewnych.  Przy ul. Bazyliańskiej znajdowała się "Bracka ławka" - sklepik z dewocjonaliami obsługiwany przez O. J. Omieliańską (1912/13 czysty zysk 291 rb), która prowadziła także czytelnię (1912/13 - 256 osób).
W 1914 były czynne 4 cerkwie (także cerkiew dla młodzieży w gmachu Akademii). Dekanat zamojski, z k. XIX w. skupiał 18 parafii. Proboszczowie: 1833-51 Mikołaj Samborski, 1851-1892 Mikołaj Straszkiewicz, 1892-1903 Antoni Gackiewicz (zm. 1906, cmentarz w Zamościu), 1903-1906 Włodzimierz Gordasewicz, 1907-15 Emilian Biekariewicz.
Liczba wiernych: 1866 - 24, 1893 - 831 (w tym 398 kobiet), 1907 - 343, 1911 - 431, 1913 - 194 (w tym głównie "rządowych" oraz m.in. 19 duchownych), a ponadto jeszcze 2136 w miejscowym garnizonie, mieszczan 19, włościan 20, 1918 - 10, XII 1919 - na Przedm. Lubelskim 30, Starym Mieście i Podtopolu po 3, Majdanie 2 i 1 na Nowej Osadzie 1, 3 1921 - 235, 1925 - 394. Prawosławni stanowili w 1893 - 7,6 % ogółu zamościan, w 1913 - 2,9 %. Po wojnie znikoma ich liczba spowodowała przyłączenie miasta do parafii w Siedliskach (proboszcz mieszkał w Zamościu przy ul. Piłsudskiego). W Wielką Sobotę prawosławni szli tam z pochodniami na nocne nabożeństwo. W 1929 zabrano z ratusza do Siedlisk prawosławne obrazy i inne sprzęty. W 1930 kościół prawosławny podjął starania o odzyskanie cerkwi św. Mikołaja. Garstce wyznawców sporadycznie służyła drewniana kaplica na cmentarzu prawosławnym (1910-38).
W III 1933 przybył z W-wy w celu założenia parafii Dymitr Kość (l. 27, zam. ul. Narutowicza), odprawiając nabożeństwa w sadzie u Jana Turczyniaka (róg ul. Folwarcznej i Nadrzecznej), gromadzące do 80 osób. Odpust 22 V 1934 odbył się z udziałem 4 popów (3 przyjezdnych) i 300 osób (w tym 200 przyjezdnych).  W ramach walki z prawosławiem rozebrano kaplicę na cmentarzu, demolowano również domy ludności prawosławnej w okolicach ul. Św. Piątka. W 1938 przybył kolejny ksiądz Andrzej Łahoła, by wykonywać praktyki religijne sposobem  domokrążnym.
W VIII 1944 był 1 ks. prawosławny w mieście oraz Józef opiekun cerkiewny. W 1946 notowano ponad 150 obywateli narodowości ukraińskiej i rosyjskiej. Sporą część stanowiły rodziny zamieszkałe w Zamościu nierzadko od poł. XIX w. i nazwiska te spotykamy w mieście do dzisiaj. Część z nich w późniejszym okresie przeszło na katolicyzm. W 1950 urzędowo stwierdzono 23 prawosławnych.
W l. 80. udzielał gościny prawosławnym kościół polskokatolicki. Dekretem metropolity Bazylego z 2 X 1986 erygowano parafię Św. Mikołaja. W 1988 powstała parafia tomaszowsko-zamojska z siedzibą w Tomaszowie, parafię zamojską sięgającą od Lubyczy i Łaszczowa, po Chomęciska i Zwierzyniec, reaktywowano w 1992, proboszczem został ks. Witold Charkiewicz (także w Tomaszowie), w VII 1993 siedzibę parafii przeniesiono do Zamościa. W 1997 liczyła ok. 80 rodzin (także z Kosobud, Krasnobrodu, Potoczka, Szewni, Łazisk, Bortatycz). Do otwarcia cerkwi przez pewien czas nabożeństwa odbywały się gościnnie w kościele św. Katarzyny. Uczestniczy w nich 20-30 wiernych. Odpust parafialny 9 V (św. Mikołaja). Dom parafialny mieścił się przy ul. Św. Piątka, od 2001 przy cmentarzu. W 2006 rozdzielono parafię, przy zamojskiej powstał dekanat zamojski (jako piąty), z 5 parafiami w Bończy, Hrubieszowie, Tarnogrodzie, Tomaszowie i Zamościu oraz 6 kaplicami filialnymi. Dziekanem został ks. Witold Charkiewicz. Parafię odwiedzali arcybiskupi Filadelfii (1994) i łódzko-poznański (1996), abp Sawa (2005), pielgrzymi greccy (1999). Cmentarz prawosławny, Cerkwie. 
Z Zamościa pochodzi Roman Miedwied męczennik prawosławia. 20 I 2012 miało miejsce przekazanie relikwii - fragment kości św. Romana "Wyznawcy" ofiarowany przez Cyryla, patriarchę Moskwy. Z Zamościem związani są inni wybitni prawosławni. W zamojskiej twierdzy więziony był poeta i dekabrysta Władimir Rajewski, urodzili się malarz symbolista Wasilij Denisow, śpiewak operowy Andriej Iwanow, teatrolog Borys Alejew, pisarz i lotnik Jurij Baranow.

 * Artykuł z 1870 wspomina o innym, otrzymanym w 1615 przywileju patriarchy jerozolimskiego, względem sprowadzenia zakonników prawosławnych, założenia bractwa i klasztoru.
  * Wg „Kuriera W-wskiego” w 1911 w Zamościu wg statystyki rządowej było 407  prawosławnych (razem z urzędnikami, strażnikami [?] i ich rodzinami, z nich do stałej ludności wszystkich tylko 22.
 * W 1922 Jordan urządzano za Bramą Szczebrzeską. Pod koniec XIX w. Święto Jordanu i święcenie wody w Łabuńce organizowały władze miejskie za kilkadziesiąt rubli budując udekorowany świerkami pomost.
 * Do byłych wojskowych Rosjan z "Białej Armii" należało kilka autobusów "Ursus". Konkurujący Żydzi wymyślali "Ursusowcom" od „bałachowców” co przynosiło im raczej zaszczyt.
 * W 1913 należało do cerkwi duchownych: 19 mężczyzn i 20 kobiet, wojskowych 2059 i 77, rządowych 150 i 106, mieszczan 13 i 66, włościan 13 i 7.