Pierwszą osobą, której przysługiwał tytuł uczonego był założyciel miasta, dr obojga praw, który swój doktorat De Senatu Romano libri II (wyd. Wenecja 1563, Strassburg 1608, 1670, wyd. krytyczne 1998) oparł na dziełach 70 autorów; ponadto miał przygotować nie znaną dzisiaj pracę De perfecto senatore, a notaty padewskie niedoszłych prac przekazał Adamowi Burskiemu - najwybitniejszemu uczonemu Akademii.
Pod egidą Zamoyskiego powstał ośrodek naukowy, który na przełomie XVI i XVII w. do zaniedbanych w kraju badań filologicznych wniósł nowy szeroki rozmach twórczy. Przy współpracy z Szymonowicem wybierano tematy badań. Starannie urządzona drukarnia naukowa, poszukiwanie i skup kodeksów starych pisarzy greckich w Konstantynopolu, kwerendy prowadzone w wielkich bibliotekach (m.in. Neapolu, Rzymie, Anglii, holenderskiej Lejdzie), kontakty i wymiana myśli z wybitnymi filologami stanowiły bogate ramy dla podjętej pracy badawczej, wykazując dość ścisłą łączność i pokrewny styl pracy z filologią francusko-holenderską, najwyżej stojącą wówczas w Europie. Zamość na krótki czas staje się głównym łącznikiem myśli naukowej z zachodem.
Zamojski ośrodek zajął się erudycyjnym opracowaniem i wydaniem mało znanych pisarzy greckich. Wydano listy św. Ignacego, utwór Dionizjusza z Halikarnasu i mowa Pseudo-Epifaniusza, przerwano jednak prace nad dziełami Jana Actuariusa (o rozpoznaniu chorób) i Herenniusza (rozmowy o metafizyce). Najambitniejszym przedsięwzięciem było odtworzenie przez Adama Burskiego logiki stoików (Dialectica Ciceronis).
Burskiemu niewiele ustępowali mu: wybitny prawnik Tomasz Drezner, świetny filolog o imponującej erudycji Jan Ursinus i Szymon Birkowski. Z późniejszych czasów na uwagę zasługują profesorowie Wojciech Gryglicjusz (hebraista, arabista, znawca syryjskiego) i Benedykt Żelechowski (autor kompendium prawniczego). Na dworze Kanclerza przebywał największy historyk tamtych czasów Reinhold Heidenstein, w Zamościu pisząc największe dzieła (Dziejów polskich ksiąg XII i Komentarze o Wojnie Moskiewskiej).
Nawiązano kontakty z innymi ośrodkami naukowymi, Zamoyski nawiązywał stosunki intelektualne planowo z takimi centrami, jak Londyn, Rzym, Lejda, Lovanium, Helmstadt, a więc z przodującymi wtedy pod względem naukowym Francją, Belgią, Holandią, Anglią, pomijając spłyconą, grzęznącą w manieryzmie kulturę włoską. goszczono wybitnych uczonych. Przez dwa lata przebywał matematyk Flamand Adrian van Roomen (1561-1615), jeden z największych ówczesnych matematyków Europy, który swymi odkryciami zaznaczył nowy etap rozwoju tej dziedziny nauki. W Akademii wykładał prawnik William Bruce. Bogatą korespondencję ze środowiskiem zamojskim prowadził wybitny humanista niderlandzki, twórca neostoicyzmu Justus Lipsius.
Zasługą Akademii na polu naukowym było przede wszystkim prekursorskie w Polsce wprowadzenie romanistyki w krąg naukowych dociekań. Zamojski ośrodek zostawił ślad w dziejach logiki i filologii klasycznej. Podjęto badania nad logiką stoików i piśmiennictwem późnogreckim. Z przyczyn "zewnętrznych" Akademia poprzestała na pierwszych skromnym owocach podjętych prac edytorskich (Drukarnia Akademicka). Po śmierci Zamoyskiego, w kontrreformacyjnej atmosferze, nastąpiło odejście od pierwotnej koncepcji, zatracenie dynamiki i aktywności, upodobniające Akademię Zamojską do Krakowskiej. 
Znaczącą rolę odegrały również powstałe w Zamościu, nastawione na znaczenie praktyczne dzieła prawnicze (Prawo). Nie rozwinęła się jedynie medycyna, poprzestając na kuriozalnym wystąpieniu w 1599 w sprawie kołtuna. W Akademii wykładano okazyjnie astronomię.
Ursinus i Stanisław Niewieski, uchodzą za prekursorów polskich badań filologiczno-przyrodniczych. Pojawili się popularyzatorzy wiedzy, jak właśnie  S. Niewieski - szeroko rozumiana przyroda, czy Stanisław Duńczewski - geografia, rolnictwo. Jego Geografia Królestwa... drukowana w 16 kolejnych kalendarzach - oprawiona funkcjonowała jako swoista podręczna encyklopedia wiedzy geograficznej o Polsce.                 
Miernikiem postępowości Akademii w 2 poł. XVIII w. był częściowo pozytywny stosunek do teorii kopernikańskiej. Generalnie jednak profesorowie byli przeciwko Newtonowi (1768), Leeuwenhoekowi (1774), Kartezjuszowi (1777, 1780), Wolterowi i "Russowi" (1779), Leibnizowi (1780), chociaż samą znajomość osiągnięć tych genialnych umysłów, uważali za godną uwagi. Na przełomie XVIII/XIX w. kilku profesorów, zaznaczonych osiągnięciami w różnych dziedzinach pracowało w Liceum Królewskim.
W XIX w. naukowe osiągnięcia notował Zdzisław Kłossowski.  Po I wojnie świat. w Zamościu Tow. Nauczycieli Szkół Średnich i Wyższych organizowało z udziałem miejscowych, jak i uniwersyteckich sił, głównie ze Lwowa tzw. "Wykłady Naukowe". Przed wojną na tym polu wyróżnił się filolog Adam Szczerbowski. Zamojski weterynarz W. Bartoszewski opublikował Doraźną pomoc weterynaryjną (Zamość 1928), ksiądz Wacław Staniszewski Duszpasterstwo w szkole (Zamość 1937). a red. Emil Migasiński m.in. Polacy w Paranie współczesnej. Obszerny artykuł o promieniowaniu opublikował Kuryerze "Literacko-Naukowym" (1939) nauczyciel gimnazjum Adolf Banaś.
W Zamościu urodzili się wybitni uczeni: Jerzy Minczewski - prof., dyrektor IBJ w Świerku, przew. Rady d/s Atomistyki, czł. PAN, Stefan Kempisty - prof. matematyk (teorii funkcji rzeczywistej); kilkudziesięciu znanych w Polsce ludzi nauki odnajdujemy wśród absolwentów zamojskiego gimnazjum i liceum.


 * W Encyklopedii Popularnej figurują profesorowie Akademii Zamojskiej: Adam Burski, Tomasz Drezner i Stanisław Duńczewski oraz prof. Liceum Królewskiego Bazyli Kukolnik.
 * Uczonym z Zamościa (brak potwierdzenia) był matematyk Gustaw Ignacy Rohn (1853-1890), który skończył z wyróżnieniem wydz. matematyki Uniwersytetu Warszawskiego, za zbudowany przez siebie przyrząd do rysowania krzywych linii Lissajousa, przedstawiających graficzne drgania tonów muzycznych i fal światła otrzymał na wystawie paryskiej medal srebrny i stopień oficera Akademii, zmarł w Warszawie po ciężkiej chorobie (sparaliżowany).