Wśród zbiorów historycznych do najcenniejszych należy przywilej lokacyjny Zamościa i berło Akademickie. Jest też chorągiew ordynacji (poł. XVIII w., adamaszkowa), panorama Zamościa (F. Bruder, 1821, akwarela, papier),
W muzeum jest bogaty zbiór portretów ordynatów (w większości przejętych w 1946 z pałacu w Klemensowie), m.in. Jana - hetmana (trzy - najstarszy z pocz. XVII w. w 2005 zakwestionowano, jako portret - nie Zamoyskiego lecz Stanisława Żółkiewskiego), Tomasza i Katarzyny z Ostrogskich (obydwa b. duże - 220x120 cm), Jana Sobiepana i Marysieńki, Marcina i jego żony Anny (obydwa M. Lomer), Tomasza Antoniego (poziomy, z pałacem w tle), Tomasza Józefa, Klemensa (jako chłopiec, mal. Ł. Smuglewicz), Konstancji (dwa, w owalu, M. Lomer?), Jana Jakuba (owalny, M. Lomer?), Teresy z Potockich, Aleksandra (mal. Franciszek Lampi), Andrzeja (mal. F. Lampi), Stanisława Kostki (mal. Kazimierz Wojniakowski), oraz Gryzeldy z Zamoyskich Wiśniowieckiej, a także portrety królów Zygmunta III i Jana III (XVIII w.). Portrety ordynatów zabrano w 1953 do Kozlówki, skąd wróciły po 5 latach.
W zbiorach jest kilka obrazów szkoły francuskiej, m.in. Bitwa Jacquesa Bourginiona (2 p. XVII w., 86x123 cm), w 1946 od konsula Król. Serbosłowackiego, wierna kopia obrazu B. Murilla Święta Rodzina z Luwru (Paryż, 2 p. XIX w., na odwrocie pieczęć Luwru), przejętego z pałacu w Klemensowie, oraz mierzący 6 m długości Rejtan wg Matejki austriackiego malarza Georga Fischhofa (1896). 
Dzieła innych artystów: 
 - Józef Brandt (Zaporożcy, 127x87, 1895),
 - Leon Wyczółkowski (akwarele: Polne kwiaty 78x45, 1923, Kaczeńce 55x48, 1918, rysunki: Na targu 39x26, Spichlerz w Kazimierzu 14x26 - spadek po M. Pieszce, autolitografia Puszcza z leżącym żubrem 48x32, 1927), 
 - Sebastian Ludwik Norblin (portret dziecka), 
 - Józef Mehoffer (obraz Park nad stawem), 
 - Maksymilian Gierymski (scena rodzajowa na tle ogrodu, 33x25), 
 - Olga Boznańska (pejzaż, 23x13,5), 
 - Juliusz Kossak (portret konny Synowie Władysława Zamoyskiego akwarela 1860, z muzeum w Krakowie w 1964),
 - Teresa Tyszkiewicz (Kwiaty, 1938)
 - Stanisław Noakowski (akwarela Kościół i brama 35x35, 1929 oraz rys. tuszem  Widok na kościół), 
 - Rafał Hadziewicz (rysunki, m.in. szkic do obrazu Trójca Św.), 
 - Józef Rapacki (12 litografii), 
 - Franciszek Kostrzewski (akwarela), 
 - Nikifor.
W depozycie jest Lisowczyk Aleksandra Orłowskiego oraz obraz Grassiego. Gierymski, Wyczółkowski, Kostrzewski, Nikifor to cenny dar z 1965  L. Różyczki z Warszawy.
Są prace o tematyce zamojskiej m.in. 7 rysunków W. Neumann-Hiszpańskiej (z 1952, od 1967),  drzeworyty T. Cieślewskiego, 42 akwarele Eustachego Mazura, akwarele Władysława Szuma (z 1967), 23 rysunki K. Gwiazdowskiego (pocz. l. 50-tych). Są prace po związanych z Zamościem malarkach: Krystynie Bronickiej (56 obrazów), Zofii Kulaszyńskiej-Couret i Jadwidze Lesiewskiej-Rozdziałowskiej (26) oraz Władysławie Żurawskim, pastele Aleksandra Dobrowolskiego. Są też prace innych zamojskich artystów (Surdacki, Podobiński, Iwańciów, Wawryn), malarstwo sakralne.
W 2002 na mocy ugody 54 obiekty uznane za własność Marcina Zamoyskiego, zostały pozostawione w Muzeum jako depozyt M. Zamoyskiego, m.in. Bruder, Lampi, Wojniakowski, Kossak (z pałacu w Klemensowie), a także 5 dużych obrazów (172x192) z kościoła franciszkańskiego - Narodziny Maryi, Wstąpienie Maryi do świątyni jerozolimskiej, Zaślubiny Maryi z Józefem, Ofiarowanie Jezusa w świątyni, Obrzezanie Jezusa.
Do interesujących eksponatów należy mahoniowa komoda "certosina", pas słucki z XVIII w., kilim ormiański z XVII/XVIII w. Są też lwowskie rzeźby sakralne (XVIII w.), puszka na komunikanty (pocz. XVII w.), kapliczka drewniana z pnia dębowego z Chrystusem Frasobliwym, z Górecka Kościelnego z 1861, pierwotnie nagrobna, fund. J. Paluch, od 1938 w muzeum.
Muzeum ma wartościowy dział archeologiczny (m.in. przedwojenne znaleziska) z największą w kraju kolekcją zabytków kultury Gotów i dział etnograficzny, (m.in. stroje, rzeźba, ceramika).
Dział numizmatyki i medali liczy 12872 eksponatów (2016), w tym 7,5 tys. monet (najstarsze denary rzymskie Trajana i Hadriana z I - II w. n.e., monety arabskie z VI w., średniowieczne, m.in. brakteaty Bolesława Krzywoustego oraz z XIV w. półgrosze Jagiełły i szelągi Krzyżackie), w tym "skarby monet" (skarb srebrnych monet rzymskich, skarby monet m.in. z XVI w.), 3,5 tys. banknotów i 800 medali.
Muzeum posiada ponad 2100 ekslibrisów, wartościowy zbiór starodruków - 119 "zamojskich" (najstarszy z 1597), archiwalia - kilkaset rękopisów, m.in. przywileje (z 6 X 1580 rzeźników wołowych) i statuty instytucji miejskich, unikalne rysunki pomiarowe (np. kościoła franciszkanów), zbiór muzealiów fotograficznych (4,3 tys. szt., najstarsze z 1887), filmotekę (ponad 700 tematów, najstarszy z 1956).
Do muzeum trafiły zbiory M. Pieszki, w tym archiwum osobiste i materiały warsztatowe - głównie wypisy archiwalne, H. Rosińskiego i innych, rękopisy Bojarczuka (kroniki), fragmenty archiwów m.in. KMK, ZHP. W 2006 liczyło 33 tys. eksponatów, 2019 - 36,8 tys.

 !!! W 1946 największy liczebnie zbiór w Muzeum stanowił - dział przyrodniczy, który obejmował bogatą kolekcję motyli, szkodników leśnych  oraz preparaty ptactwa wodnego owadożernego, drapieżnego, gryzoni, płazów, skamienieliny kości mamuta i zbiór okazów mineralogicznych. (za "Zdrojem" nr 5 z 1946)
 * Największe skarby monet w Muzeum:
 - Polanówka (1960) - 375 monet pol. z 1414-1538
 - Suchowola (1967) - 134 monety pol. i obce z 1613-1640
 - Turkowice (1972) - 558 monet pol. i obcych z 1612-1692
 - Potoczek (1989) - 36 monet pol. i obcych z 1615-1702
 * Na chorągwi ordynackiej  z jednej strony widnieje tarcza herbowa zwieńczona koroną z półkozicem, z drugiej Matka Boża Niepokalanie Poczęta w technice olejnej, obszyta na przemian żółtymi, czerwonymi i niebieskimi frędzlami.
 * Zaporożcy pochodzą z jednego z dworków pod Lwowem. W opuszczonym domostwie znalazł obraz wycofujący się spod Kijowa żołnierz WP (wyciął bagnetem i schował za cholewę), po wojnie wrócił do domu pod Turobin, oprawił i zawiesił na ścianie. Ok. 1930 został sprzedany księdzu spod Tomaszowa, a w 1979 odkupiony przez muzeum.
 * W 1962 Muzeum na Wawelu zabrało z zamojskiego Muzeum obraz Wjazd Ossolińskiego do Rzymu, w zamian przekazując w bezterminowy depozyt 5 obrazów ze zbiorów wawelskich, m.in. Wojniakowski, Kossak, Lampi.
 * Muzeum prowadziło konserwację posiadanych obrazów olejnych na płótnie, 1960 - Portret Augusta II, k. XVIII (74x58 cm), Portret Augusta II, k. XVIII (77x56 cm), Portret królowej Konstancji (105x87 cm), Scena bitewna, XVII (86x123 cm), 1961 - Upolowana zwierzyna (99x187 cm), 1963 - Portret Gryzeldy Konstancji Zamoyskiej, XVIII (86x55 cm), 1966 - Portret Jana Zamoyskiego, XVIII (251x164 cm), Portret Katarzyny z Ostrogskich Zamoyskiej, XVII (25x125 cm), Portret Marcina Zamoyskiego, po 1859 (116x144 cm), Portret Tomasza Zamoyskiego, XVIII (218x135 cm). Konserwacji poddano też obraz Zygmunta III Wazy.