Powstało w 1936 jako Muzeum Regionalne PTK. Tę ukształtowaną już instytucję  otwarto ponownie po wojnie, ale ponieważ próby reaktywowania pod patronatem PTK nie dały rezultatu 2 V 1945 otwarte zostało jako miejskie już - Muzeum Ziemi Zamojskiej. Powstały też ekspozycje też w kojcu i Rotundzie. W 1948 frekwencja wyniosła 24.357 osób, w tym 17.243 młodzieży, w 1959 - 38.106. W 1948 podjęto skuteczne starania o sąsiednią kamienicę nr 24. W 1972 frekwencja 20 tys. oraz 5,5 tys. w kojcu. 20 XII 1949 podpisano akt przejęcia muzeum od miasta przez ministerstwo (w jego imieniu wystąpiła Maria Suchodolska) i 1 I 1950 zostało upaństwowione.
Urządzono stałe ekspozycje w 1952 Dzieje społeczeństw pierwotnych (archeologia) i w 1953 Kultura ludowa południowej Lubelszczyzny (etnografia) w 1954 Dzieje Zamościa i południowej Lubelszczyzny (historia), scen. A. Iskrzyckiego, z katalogiem, oraz magazyn przyrodniczy. W 1958 było 2217 muzealiów (najwięcej historia - 917 i etnografia - 762), 1966 - ok. 4 tys. W 1962 przy muzeum otwarto sklepik z pamiątkami. Od 1963 obsadę stanowiły same kobiety (5). W 1964 muzeum gościło muzeologów z całej Polski. W 1972 - 8049 eksponatów.
Remontowane na przełomie 1956/57, po kolejnym trzyletnim remoncie, 14 X 1967 otwarto nowo urządzone ekspozycje: Kultura Zamościa i Zamojszczyzny scen. K. Sroczyńskiej i J. Kowalczyka, Zamojszczyzna w okresie okupacji hitlerowskiej M. Gąszczyk (razem 10 izb) i Kultura ludowa regionu zamojskiego J. Petery (5 izb), w której prezentowano stroje ludowe, garncarstwo, narzędzia rolnicze i sprzęty gospodarcze. Były też eksponaty przyrodnicze, gł. ornitologia. Uchodziło za jedno z piękniejszych muzeów regionalnych w Polsce. W 1975 placówkę (10,6 tys. eksponatów) przekształcono w Muzeum Okręgowe, w skład którego weszły na prawach oddziałów muzea w Biłgoraju, Hrubieszowie i Tomaszowie. 15 IX 1978 ekspozycje zamknięto, a zbiory na czas renowacji zmagazynowano (przez 9 lat biura mieściły się krótko w kinie, potem w Domu Centralnym). 
"Nowe" muzeum PKZ przekazały do użytku 31 XII 1988, otwarte 11 X 1989. Wróciło do kamienic ormiańskich (ponad 3 tys. m20 - teraz aż czterech (nr 24-30), 26 sal ekspozycyjnych - z 17,5 tys. eksponatami (najwięcej numizmatyka 6702, sztuka 3781 i etnografia 2344). W 2011 ponad 40 tys. eksponatów, prezentowane dotąd na ok. 600 wystawach. Od 1993 udostępniana sukcesywnie stała wystawa Historia Zamościa i Ordynacji Zamojskiej 1580-1939 scen. Waldemara Maziarczyka. Powstały też stałe ekspozycje Zamojszczyzna  w  pradziejach i wczesnym średniowieczu (1991) oraz Sztuka ludowa Zamojszczyzny, a także Galeria Sztuki Sakralnej i Galeria Studyjna. Muzeum podlega ekspozycja w Rotundzie (dawniej także w kojcu). W 1992-94 czyny był antykwariat muzealny. Od 1 X 1999 nosi nazwę Muzeum Zamojskie (pozbyło się oddziałów) gromadzi dobra kultury z obszaru miasta, powiatu i sąsiednich regionów. Teraz z biletów pokrywa się ok. 15% potrzeb. W 2007 oprowadzono po muzeum 800 grup. 2008 - 21 pracowników. Pod koniec l. 90. rocznie muzeum odwiedzało ok. 20 tys., arsenał ok. 50 tys., a rotundę ok. 10 tys. W ciągu ostatnich 15 lat muzeum wraz z arsenałem zwiedziło 880 tys. osób (2011). Frekwencja w muzeach 2011-2021 - 65,3, 24,7, 48,8, 55,4, 97,8, 102,3, 107,1, 106,6, 90,7, 39,5. Po modernizacji  muzeum 2019 - 88 tys., w IV - IX 2019 muzeum odwiedziło 23 tys. osób.
Organizowano sesje i konferencje, targi sztuki ludowej (od 1970), cykle odczytów (1975-1983), koncerty, współpracowano z Politechniką Krakowską i UMCS. Przygotowano dwie wielkie wystawy: poświęconą miastu na Zamku Królewskim (1985) i Skarby wschodnich Gotów w Bevern w Niemczech, której otwarcie zaszczycili przewodnicząca Bundestagu i minister spraw zagranicznych (1995), a w Europie parokrotnie prezentowano Zamość - miasto renesansu z modelem miasta (osobne hasło) oraz współorganizowano wystawę w Schwäbisch Hall. Wypożyczano eksponaty, głównie portrety ordynatów, m.in. na wystawy Polaków Portret Własny (1979) i Kultura epoki saskiej (1997). Użyczano też zamojskie eksponaty na wystawy zagraniczne do Wiednia (portret Jana III Sobieskiego) i Berlina (kapliczka z Górecka).
Były też oryginalne wystawy, których bohaterem był miód i wosk (2001), chleb, Biskupin (1992), wystawa Biblii - 130 eksponatów (1999), prezentowano różne aspekty kultury materialnej, Zamojskie Madonny i Sztuka sakralna diecezji zamojsko lubaczowskiej (1999), lalki (1999), kostiumy filmowe z "Ogniem i Mieczem" (2000), Egipt kraj faraonów i fellachów (1992), Indonezja - kraj tysiąca wysp (1997), Sztuka Indii (1998), Azji i Pacyfiku (2001). Podczas wystaw można było oglądać prace znanych polskich malarzy (Malarstwo polskie i obce w Zamościu). Wystawa Ars Armeniaca zajęła II w Polsce w wśród muzealnych wystaw sztuki 2010. Z końcem l. 90-tych odbywały się też  siłami miejscowych muzyków Koncerty w Muzeum. Muzeum bije pamiątkowe monety z oblężenia. W 2003 muzeum zwiedził premier Leszek Miller.
Szefowie muzeum: 1950-51 Władysław Kabat, 1951-52 Janusz Optołowicz, 1952-60 Ryszard Splewiński, 1960-90 Maria Lorentz, 1990-2021 Andrzej Urbański, od 2021 Anna Cichosz (od 1975 dyrektorzy). W 2021 zatrudnia 46 osób.

 * Współpracująca z zamojskim kustosz muzeum lubelskiego Maria Żywińska - Posiadało ono dość poważne zbiory: desek i przyrządów do drukowania płócien, ceramikę ludową, pisanki, stroje oraz kilka pamiątek z twierdzy.
 * W 1947 pracowali kustosz W. Kabat i dozorca F. Szydłowski, 1950 - W. Kabat (kustosz), T. Szałowska (referendarz), F. Szydłowski (st. woźny) i A. Kosmala (st. woźny).
 * W protokole przekazania z 20 XII 1949 znalazły się następujące grupy eksponatów: sztuka 235, rzemiosło artystyczne 376, grafika 283, prehistoria 306, historia 880, numizmatyka 980, przyroda 1800, martyrologia 1300, różne 700 oraz 161 depozytów, których właścicielami byli m.in. ks. Zawisza 18 (3 VI 1939), Kamilla Kopcińska 3 (29 IV 1945), Stanisław Mateja 5 (26 VI 1946), Józef Jednacz 2 (14 VI 1947) i Stefan Miler 1 (14 V 1949) a także władze powiatowe 50 (14 III 1937, 17 III 1939).