Pierwotny manierystyczny ołtarz główny, wykonany z drewna lipowego w 1635-37 przez Fabiana Möllera z Gdańska (wg dyspozycji w testamencie Zamoyskiego, miał być marmurowym, jednym z pierwszych w świątyniach polskich), znajduje się obecnie wraz z obrazami w kościele w Tarnogrodzie.
Obecny stiukowy ołtarz powstał w 1783-85 i otrzymał monumentalną późnobarokową formę, nawiązującą do popularnej odmiany ołtarzy zapoczątkowanej pół wieku wcześniej przez ołtarz jasnogórski. Na tle żywiołowej dekoracji i bogactwa rozwiązań tamtych czasów, ołtarz zamojski cechuje umiarkowanie, rodzaj pewnej elegancji, jakkolwiek wyraźnie się odczuwa się dysonans z odmiennym stylowo wnętrzem kościoła. Zwieńczenie tworzy Trójca Św. w otoczeniu aniołów, glob ziemski i złota korona ponad wszystkim (okrągłe okno z wyobrażeniem Ducha Św. staje się niczym w monstrancji - promienista glorią). Na tle złotych i szarych barw ołtarza wyraziście rysują się jasne figury Książąt Kościoła - św. Piotra i św. Pawła oraz patronów fundatora Kolegiaty - św. Jana Chrzciciela i św. Jana Ewangelisty (obraz ołtarzowy św. Tomasza przed Zmartwychwstałym Chrystusem - osobne hasło - Obrazy katedralne). Wg obrazu Zaleskiego w przeszłości znajdowały się malowidła na sklepieniu prezbiterium.
Również pierwotne, srebrne tabernakulum z 24 figurami w drzewie tego samego co ołtarz autora, po stu latach zastąpiło nowe srebrne cyborium. Było jeszcze okazalsze a wykonali je wrocławscy złotnicy. Jest jednym z najciekawszych dzieł złotnictwa na ziemiach polskich, a niewątpliwie najwspanialszym rokokowym tabernakulum w Polsce. Stał w nim wielki srebrny pacyfikał z relikwiami św. Jana z Dukli (pocz. XVII w., ob. Muzeum Sakralne).
W prezbiterium stoją także mogące pomieścić 20 osób rzeźbione stalle kanonicze (K. Ptaszyński, 1905), wcześniejsze stalle cz. srebrzone, oraz współczesny tron infułacki. Ze sklepienia zwisa lampa wieczna misternej roboty (1714). Odgradza prezbiterium od nawy neorenesansowa, żelazna balustrada z motywem wici akantowej i rozetami (J. Falkowski z Warszawy, pocz. XX w.). W nawie stało niegdyś 20 ławek malowanych (symbole z Pisma św.).